PCR, ass d'Polymerase Kettenreaktioun, déi op d'Additioun vun dNTP, Mg2+, Verlängerungsfaktoren a Verstäerkungsfaktoren zum System ënner der Katalyse vun DNA Polymerase bezitt, andeems d'Elteren-DNA als Schabloun a spezifesche Primer als Ausgangspunkt vun der Verlängerung benotzt gëtt. Duerch d'Schrëtt vun Denaturatioun, annealing, Extensioun, etc., kann de Prozess vun in vitro replizéiert Duechter Strang DNA komplementar zu der Elterendeel Strang Schabloun DNA séier a spezifesch all Zil-DNA in vitro amplify.
1. Hot Start PCR
D'Startzäit vun der Verstäerkung am konventionelle PCR ass net d'PCR Maschinn an d'PCR Maschinn ze setzen, an da fänkt de Programm un ze verstäerken.Wann d'Systemkonfiguratioun fäerdeg ass, fänkt d'Verstäerkung un, wat net spezifesch Verstäerkung verursaache kann, an Hot-Start PCR kann dëse Problem léisen.
Wat ass Hot Start PCR?Nodeems de Reaktiounssystem virbereet ass, gëtt den Enzymmodifikateur bei héijer Temperatur (normalerweis méi héich wéi 90 ° C) während der initialer Heizungsstadium vun der Reaktioun oder "Hot Start" Etapp verëffentlecht, sou datt d'DNA Polymerase aktivéiert gëtt.Déi exakt Aktivéierungszäit an Temperatur hänkt vun der Natur vun der DNA Polymerase an dem Hot-Start Modifikateur of.Dës Method benotzt haaptsächlech Modifizéierer wéi Antikörper, Affinitéitsliganden oder chemesch Modifizéierer fir d'Aktivitéit vun DNA Polymerase ze hemmen.Zënter datt d'Aktivitéit vun DNA Polymerase bei Raumtemperatur inhibitéiert ass, bitt Hot Start Technologie grouss Komfort fir verschidde PCR Reaktiounssystemer bei Raumtemperatur virzebereeden ouni d'Spezifizitéit vu PCR Reaktiounen ofzeschafen.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) ass eng experimentell Technik fir ëmgedréint Transkriptioun vu mRNA an cDNA a benotzt et als Schabloun fir Amplifikatioun.Déi experimentell Prozedur ass fir d'éischt total RNA an Stoffer oder Zellen ze extrahieren, Oligo (dT) als Primer ze benotzen, ëmgedréint Transkriptase benotzt fir cDNA ze synthetiséieren, an dann cDNA als Schabloun fir PCR Amplifikatioun ze benotzen fir den Zilgen ze kréien oder Genausdrock z'entdecken.
3. Fluoreszent quantitativ PCR
Fluoreszent quantitativ PCR (Echtzäit Quantitativ PCR,RT-qPCR) bezitt sech op d'Method fir Fluoreszentgruppen an de PCR-Reaktiounssystem ze addéieren, andeems d'Akkumulatioun vu fluoreszent Signaler benotzt fir de ganze PCR-Prozess an Echtzäit ze iwwerwaachen, a schliisslech d'Standardkurve benotzt fir d'Schabloun quantitativ ze analyséieren.Allgemeng benotzt qPCR Methoden och SYBR Green ech an TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR bezitt sech op d'Benotzung vun zwee Sätz vu PCR Primer fir zwou Ronne vun der PCR Amplifikatioun, an d'Verstäerkungsprodukt vun der zweeter Ronn ass d'Zilgenfragment.
Wann e Mëssverständnis vum éischte Pair vu Primer (äusseren Primer) verursaacht datt en net-spezifesche Produkt amplifizéiert gëtt, ass d'Méiglechkeet datt déi selwecht net-spezifesch Regioun vum zweete Pair vu Primer unerkannt gëtt a weider amplifizéiert ass ganz kleng, sou datt Amplifikatioun duerch dat zweet Pair vu Primer, ass d'Spezifizitéit vum PCR verbessert ginn.Ee Virdeel fir zwou Ronne vu PCR auszeféieren ass datt et hëlleft genuch Produkt aus limitéierter Start-DNA ze verstäerken.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR ass eng Method fir d'Spezifizitéit vun der PCR Reaktioun ze verbesseren andeems d'PCR Zyklus Parameteren ugepasst ginn.
Am Touchdown PCR gëtt d'Annealtemperatur fir déi éischt Zyklen e puer Grad iwwer der maximaler Glühtemperatur (Tm) vun de Primer gesat.Méi héich annealing Temperatur kann effektiv net-spezifesch Amplifikatioun reduzéieren, mä zur selwechter Zäit, méi héich annealing Temperatur wäert d'Trennung vun primers an Zil- Sequenzen verschlechtert, doraus zu reduzéiert PCR Rendement.Dofir, an den éischte puer Zyklen, ass d'annealing Temperatur normalerweis gesat fir 1 ° C pro Zyklus erofzesetzen fir den Inhalt vum Zilgen am System ze erhéijen.Wann d'Glühungstemperatur op déi optimal Temperatur erofgesat gëtt, gëtt d'Glühungstemperatur fir déi verbleiwen Zyklen behalen.
6. Direkter PCR
Direkt PCR bezitt sech op d'Verstäerkung vun Zil-DNA direkt aus der Probe ouni d'Nukleinsäureisolatioun a Reinigung ze brauchen.
Et ginn zwou Zorte vu direkten PCR:
direkt Method: huelt eng kleng Quantitéit vun Prouf a fügen se direkt un PCR Master Mix fir PCR Identifikatioun;
knacken Method: no der Prouf Prouf, füügt et an d'Lysat, lyse fir de Genom ze befreien, huelt eng kleng Quantitéit vum lyséierte Supernatant a füügt et op PCR Master Mix, maacht PCR Identifikatioun.Dës Approche vereinfacht den experimentellen Workflow, reduzéiert d'Hand-on Zäit, a vermeit DNA Verloscht während Reinigungsschrëtt.
7. SOE PCR
Gen Splicing duerch Iwwerlappungsverlängerung PCR (SOE PCR) benotzt Primer mat komplementären Enden fir PCR Produkter ze bilden iwwerlappend Ketten, sou datt an der spéider Amplifikatiounsreaktioun, duerch d'Verlängerung vun den iwwerlappenden Ketten, verschidde Quelle vun enger Technik, an där amplifizéiert Fragmenter iwwerlappt sinn. an zesummegefaasst.Dës Technologie huet am Moment zwee Haaptapplikatiounsrichtungen: Bau vu Fusiounsgenen;Gen Site-directed Mutatioun.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) benotzt ëmgedréint komplementär Primer fir aner DNA Fragmenter wéi déi zwee Primer ze amplifizéiert, a verstäerkt onbekannte Sequenzen op béide Säiten vun engem bekannten DNA Fragment.
IPCR gouf ursprénglech entwéckelt fir d'Sequenz vun benachbaren onbekannte Regiounen ze bestëmmen, a gëtt meeschtens benotzt fir Gen-Promotorsequenzen ze studéieren;onkogene chromosomal Ëmännerungen, wéi Genfusioun, Translokatioun an Transpositioun;a viral Genintegratioun, ginn och elo allgemeng benotzt Fir Site-directed Mutagenese, kopéiert e Plasmid mat der gewënschter Mutatioun.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) ass eng Technik fir d'absolut Quantifikatioun vun Nukleinsäuremolekülen.
Et ginn de Moment dräi Methoden fir d'Quantifizéierung vun Nukleinsäuremoleküle.Photometrie baséiert op der Absorptioun vun Nukleinsäuremoleküle;Echtzäit fluoreszent quantitativ PCR (Real Time PCR) baséiert op dem Ct Wäert, an de Ct Wäert bezitt sech op d'Zyklusnummer entsprécht dem Fluoreszenzwäert deen erkannt ka ginn;digital PCR ass déi lescht quantitativ Technologie baséiert op Single-Molekül PCR Method fir Nukleinsäure Quantifikatioun ze zielen ass eng absolut quantitativ Method.
Post Zäit: Jun-13-2023